بررسي ميكروب هاي داخلی و خارجی زنبور عسل سالم

مواد و روش ها فلور خارجي فلور داخلی نحوه توزيع ميكروارگانيسم ها بحث

Am.Foulbrood   Eu.Foulbrood  System Biologic Acarapis Nosema Varroa Honey Honey Standard Tropilaelaps Feedback Photo Album

  

ترجمه:  دكتر سيمين عقيلی ، دكتر محمد فرسي

 

     تابستان 1382      

 

 

 مقدمه

 

    در تحقيقات اخير حدود 8000 گونه ميكروب يا ميكروبهاي مفيد در زنبور عسل شناخته شده كه در فعل وانفعالات بدن زنبور عسل شركت دارند.

 بعضي در هضم مواد همكاري مي نمايند ، برخي ويتامينها را مي سازند ، گروهي در عمل آوري گرده نقش داشته و محافظ گرده از فساد هستند، گروهي آنتي بيوتيكها و گروهي ضد قارچها را توليد نموده و در ايمني زنبور دخالت دارند.

بايد دانست كه استفاده بي رويه ازآنتي بيوتيكها اين ميكرو ارگانيسم هاي مفيد را از بين برده وزنبور عسل را از مزاياي آنها بي بهره مي سازد. تحقيق حاضر به بررسي ميكروبها و قارچهايي كه در بدن زنبور عسل سالم بطور طبيعي وجود داشته و با زنبور همزيستي دارند مي پردازد.

  در طول دوره گلدهي مركبات و پنبه، ميكرو ارگانيسم هايي از سطح بدن و بخش هاي داخلي زنبوران سالم جدا شدند. باكتريها و مخمرهاي سطح  بدن شامل باسيل هاي اسپوردار , لاكتو باسيل , ميكروكوك، سارسينا، باسيل هاي گرم منفي، اكتينو ميسس، كانديدا و ساكارو ميسس بودند. باكتريهاي اسپور دار غالب بوده و سايرين نسبتاً درصد كمتري داشتند.

 باكتريهاي جدا شده از معده و روده زنبوران كارگر به همان گروههايي كه از سطح بدن جدا شدند تعلق داشتند. باكتريهاي اسپوردار در معده غالب، در حاليكه در روده هم باكتريهاي اسپور دار و هم لاكتوباسيل ها برتري داشتند.

 انواع باكتريهاي شايع تشخيص داده شدند. هيچ تفاوت معني داري بين فصل مركبات و پنبه ديده نشد.

گزارشات متعدد نشان ميدهد كه تعدادي از ميكروارگانيسم ها بطور طبيعي داخل و روي بدن حشرات وجود دارند. اولين بررسی ها دال بر وجود ميكروارگانيسم ها در زنبوران عسل يا در زنبورستان توسط ويشي در سال 1959انجام شده است. اين ارگانيسم ها بطور كامل توصيف نشده اند. با اين وجود اغلب تحقيقات پيشين به ميكروارگانيسم هاي بيماريزا مثل لوك اروپايي يا آمريكايي، سپتی سمي و غيره پرداخته اند , فقط چند بررسي راجع به باكتريهاي روده زنبور عسل در گذشته انجام شده است.

تحقيق حاضر به بررسي ميكروارگانيسم هايي پرداخته است كه  در  بدن زنبور عسل سالم يافت ميشوند, پرداخته است.

 

مواد و روش ها:

در طول فصل گل دهي مركبات (ارديبهشت و خرداد) و پنبه (تير تا شهريور) زنبوران كارگر در لوله هاي آزمايش استريل در هنگام بازگشت به كندو و حوالي ساعت 11 صبح جمع آوري شدند . اين لوله ها را در جلوي دريچه پرواز قرار داده وقتي تعداد مناسبي زنبور در آن جمع مي شد با يك درب كائوچويي مسدود و فوري به آزمايشگاه انتقال داده ميشد. در آنجا با يك پنبه آغشته به اتر زنبوران را بي هوش نموده ومنفذ دهاني ومخرج زنبوران با يك مخلوط ذوب شده از موم و وازلين مسدود ميگرديد.

براي تعيين ميكروفلور سطح بدن ، هر حشره را در لوله آزمايش حاوي  4 سي سي محلول آب نمك نرمال كاملاً تكان داده تا ميكروارگانيسم ها جدا شوند.

ميكروفلور روده و معده زنبوران نيز بررسي گرديد. برای اين کار حشره را در لوله حاوي1/0% درصد كلرور جيوه بمدت 5 دقيقه بخوبي تكان داده , محلول ميکروب کش حاصله راخارج کرده و زنبوران را سه مرتبه با‌ آب مقطر شستشو مي دهيم. سپس حشره را داخل پتري ديش قرار داده و قطعات بدني را با اجتناب از برش اپيتليوم روده از پهلو، بطور طولي شكاف داده و  روده مياني و خلفي را از لوله گوارش جدا نموده و به يك لوله حاوي 4 سي سي آب نمك نرمال منتقل مي نماييم. معده را با يک برش از پيش معده و مري جدا نموده , در آب نمك قرار داده می شود. روده و همچنين معده را به كمك ميله شيشه اي در آب نمك بهم زده و بصورت يكنواخت در مي آوريم.

ارگانيسم ها با روش خالص سازي در پليت با استفاده از محيط پايه کشت و جدا سازی می شوند.

محيط پايه (عصاره گوشت گاو 3/0% عصاره مخمر 3/0% ، پپتون 5/0%، تريپتون 5/0% ، عصارةگوجه فرنگي 5% ، گلوكز 25/0% ، لاكتوز 25/0% ، آگار 5/1% در آب مقطر و 7=PH )

 و محيط آگار عسل ( پپتون 5/0% ، عصاره گوشت گاو 3/0% ، عصاره مخمر  3/0% ، عسل 5/2% ، آگار 5/1% در آب مقطر و 7= PH) براي باكتريها .

 و آگار ورت (عصاره گوشت 3/0% ، پپتون5/0% ، آگار 5/1% در آگار شيرين ورت 10 Balling ) و آگار عسل (4/5 = PH) براي مخمرها.

بعد از نگهداري در 30 درجه سانتي گراد به مدت  48 ساعت ، كلني ها از دو بخش جداگانه از پليت ها انتخاب شده و در شير ليتموس كشت داده ميشود. همه كلني هاي جدا شده با كشت خطي در پليت آگار مناسب خالص سازي ميشوند.

باكتريها بر حسب شكل سلول، واكنش گرم، هوازي بودن، توليد كاتالاز واكنش با شير ليتموس  و تخمير دكستروز و سوكروز دسته بندي ميشوند.

تيپ هاي باسيل هاي اسپوردار بر اساس دستورالعمل برگی در سال1957, لاكتوباسيل ها بر اساس دستورالعمل گيبسون و عبدالملك در سال 1945 و ميكروکوك ها بر اساس دستورالعمل عبدالملك و گيبسون در سال 1948دسته بندي شدند. براي تفكيك قارچ ها از  روش لودر و کريژر 1952 استفاده گرديد.

 

توزيع تعداد باكتري و گروههاي باكتريايي:

الف - فلور خارجي :

در طول فصول گلدهي مركبات و پنبه به ترتيب تعداد 798 و 518 ارگانيسم از 50 زنبوركارگر در هر فصل جدا وبه شش گروه تقسيم بندي گرديدند.

باسيل هاي اسپوردار, ميكروكوك ها- سارسينا- لاكتوباسيل ها - باكتريهاي ميله اي گرم منفي و اكتينوميس ها.

جدول شماره 1، درصد توزيع اين گروهها را در دو محيط کشت در زمان گلدهي مركبات و پنبه نشان ميدهد.

 بنظر ميرسد كه محيط پايه تعداد باكتري و گروههاي باكتريايي بيشتري از محيط عسل(7=( PH را نشان ميدهد. در همه موارد كلني ها از دو بخش مقابل در پليت با رقت مشابه برداشته شده و در نتيجه نشانگر نيمي از كلني هاي رشد يافته ميباشند.

جدول شماره 1، درصد توزيع تعداد باكتري و گروههاي باكتريايي را در دو محيط کشت در زمان گلدهي مركبات و پنبه :

 

 

 

جداي از فصل، باسيل هاي اسپور دار هوازي غالب بودند (83% - 67%) ، ميكروكوك ها و سارسينا 20% -8% را تشكيل داده در حاليكه باكتريهاي گرم منفي ميله اي ، اكتينوميست ها و لاكتوباسيل ها درصد كمتري داشتند .

تركيب غالب كشت سطح بدن هر كدام از زنبوران كه به تنهايي كشت داده ميشد با ارقام موجود تفاوت چنداني نداشت.

تقريباً تعداد مشابهي از مخمرها بعد از غني سازي در طول دو فصل جدا گرديد، تمام موارد جدا شده 142)مورد) به دو نوع كانديدا و ساكاروميسس ها تعلق داشتند.

 

ب - فلور داخلی :

فلور روده : باكتريهاي جدا شده از روده (مياني و خلفي) زنبوران كارگر (50 نمونه زنبور در هر فصل) به گروههاي ذيل تعلق داشتند :

باسيل هاي اسپوردار، لاكتوباسيل ها,استرپتوكوكسي، ميكروكوكسي و باسيل هاي گرم منفي(جدول2)

هيچ تفاوت معني داري بين فصول مركبات و پنبه مشخص نگرديد و بطور كلي گروههاي غالب در كشت پايه باكتريهاي اسپوردار (41-46% ) بودند , سپس لاكتوباسيل ها (30-33% ) , باكتريهاي گرم منفي( 17% ) و استرپتوكوك ها وميكروکوك ها گاهي به ميزان پايين ظاهر شدند.

 در محيط عسل باسيل هاي اسپوردار 61-63%  ميكروبهاي جدا شده بودند و گروههاي ديگر به ميزان كم حضور داشتند.

در فصل مركبات و پنبه به ترتيب 115  و 98 سويه مخمر يافت گرديد که روي محيط ورت و عسل با 5/4= PH كشت داده شد كه به گروههاي كانديدا و ساكارو ميست تعلق داشتند. كانديدا در طول فصول ذكر شده 77-86% كل مخمرها را تشكيل مي دادند.

 

جدول2 :درصد توزيع تعداد باكتري و گروههاي باكتريايي را در دو فصل گلدهي مركبات و پنبه

 

 

 

 فلور معده:

ميكروارگانيسم ها از معدة 50 زنبوركارگر فقط در طول فصل مركبات جداسازي شد, براي جداسازي باكتريها از محيط پايه (885 تا جدا شده) و براي جداسازي مخمرها از محيط ورت (130 تا جدا شده ) استفاده گرديد.

 باسيل هاي اسپوردار مجدداً اغلب باكتريهاي جدا شده را تشكيل ميدهند (6/61%) لاكتوباسيل و استرپتوكوكسي 31%  در حاليكه ميكرو كوك ها اكتينوميست ها و باكتريهاي گرم منفي هميشه حضور نداشتند و فقط 4/7% را تشكيل ميدادند

همه مخمرهاي جدا شده در معده به دو گونه كه در سطح بدن نيز بودند محدود شده و شامل كانديدا (63%) و ساكاروميسس (37%)  ميباشند.

نحوه توزيع ميكروارگانيسم ها:

در جدول شماره 3 و 4 نشان داده شده است . توزيع درصدي تيپ هاي مختلف از يك گروهِ معين از كل تعداد جدا شده از دو محيط (پايه و عسل) برآورد گرديد و معدل درصد تيپ هاي مخصوص فقط اندكي در دو محيط تفاوت داشتند.

1- باسيل هاي اسپوردار هوازي :

سطح بدن :از سطح بدن زنبوران كارگر در طول فصل مركبات 540 نمونه گونه باسيلوس جدا شده و در طول فصل پنبه 418 نمونه  که به شش گونه دسته بندي می شوند : سوبتيليس ، سرئوس، باديوس، پوميلوس، كوآگولانس،  و مگاتريوم .

 همانگونه كه در جدول 3 نشان داده شده در هر دو فصل باسيلوس سوبتيليس گونه غالب است كه حدود 72/68% باسيلوس ها  را تشکيل داده است .

باسيلوس سرئوس، باديوس، پوميلوس، و كوآگولانس در هر دو فصل به ميزان محدود مشاهده گرديدند. باسيلوس مگاتريوم در فصل پنبه جدا نگرديد و در طول فصل مركبات يك بار و از 540 نمونة جدا شده 10 نمونه باسيلوس مگاتريوم بود كه نشانگر 2% كل باكتريهاي اسپوردار است.

 

معده و روده :در طول فصل مركبات، همان گونه ها بجز باسيلوس سرئوس و باسيلوس مگاتريوم در معده يافت شدند در حاليكه در روده فقط باسيلوس هاي سوبتيليس و سرئوس و باديوس تشخيص داده شدند.

 باسيلوس سرئوس در فصل پنبه در روده يافت نشد و فقط باسيلوس هاي سوبتيليس و باديوس مشاهده شدند.

 همانند سطح بدن باسيلوس سوبتيليس در معده و روده زنبوران كارگر غالب بود.

2- لاكتوباسيل ها:

لاكتوباسيل هاي جدا شده بدو تيپ تخمير كننده همسان و غير همسان طبقه بندي شدند.

 در سطح بدن زنبوران عسل اين دو تيپ كم و بيش برابر بودند. در معده همانند سطح بدن همان دو تيپ يافت گرديد اما لاكتوباسيل هاي تخمير كننده ناهمسان برديگري برتري داشته در حاليكه در روده لاكتوباسيل هاي همسان غالب بودند. هيچ تفاوتي بين فصول مشاهده نشد.

جدول3 ميزان شيوع باسيلوس ها و لاکتو باسيل ها در سطح بدن و روده و معده زنبور عسل در دو فصل مرکبات و پنبه

 

 

3- ميكروكوك ها :

 همانگونه كه در جدول 4 نشان داده شده در سطح بدن زنبوران ميكروكوكهاي لوتئوس و واريانس غالب بودند. ساير ميكروكوك هاي جدا شده شامل استافيلوكوك ها و درصد خيلی پاييني  از تيپ هاي واسطه اي(2%) بودند . در معده و روده ميكروكوك واريانس تنها گونه جدا شده در هر دو فصل بود.

 

جدول 4 : ميزان شيوع ميكروکوك ها و باسيل هاي گرم منفي در سطح بدن و در روده زنبور عسل در دو فصل مرکبات و پنبه :

 

                                        

4 - باسيل هاي گرم منفي :

ميزان شيوع گروههاي مختلف باسيل هاي گرم منفي جدا شده در جدول 4 ديده ميشود.

گروه غالب جدا شده از سطح بدن و روده زنبوران گروه كلي باسيل هوازي بودند. از تيپ هاي ديگر آكروموباكتر و سراتيا تنها تيپ هايي بودند كه در سطح بدن زنبوران يافت شدند.

درصد اندكي از آلكاليژن ها (2% ) از روده چند زنبور در فصل پنبه جدا شده .

 

بحث :

زنبوران عسل با پرواز طولاني براي جمع آوري شهد و گرده گل در معرض ميكروارگانيسم هاي مختلف ميباشد. ساختمان بدني آنها براي حمل گرده به قدری مناسب طراحي شده که ممكن است موهاي سطح بدن حشره ,گونه هاي مختلف ميكروارگانيسم ها را منتقل نمايد.

ميكروارگانيسم های گوناگون شامل باكتريها و مخمرها چسبيده به سطح بدن حشره مشاهده شده اند. اغلب باكتريها را اسپوردارها تشکيل می دادند. تيپ هاي ديگر از جمله ميكروبهاي ميله اي گرم مثبت بدون اسپور , فرم هاي كوكسي، گرم منفي هاي ميله اي كوتاه و اكتينوميست ها به ميزان نسبتاً كمي حضور داشته , مخمرها به تعداد محدودي ديده شده اند. اين نتايج نشان ميدهد كه تيپ هاي ميكروارگانيسم هاي مربوط به زنبور عسل ممكن است اساساً با آنهائيكه در ساير حشرات هستند تفاوت داشته باشد.

 غير ممكن است كه دقيقاً تيپ هاي ميكروارگانيسم هاي زنبور عسل را در فصول مختلف تعيين نمود، با اينكه عملاً تفاوتي در تيپ ها و درصد آنها در طول دو فصل گلدهي مركبات و پنبه مشاهده نشد.

ميكرو ارگانيسم هاي جدا شده از سطح بدن زنبوران شامل باسيلوس هاي سوبتيليس , سرئوس , باديوس , پوميلوس، كواگولانس، مگاتريوم، سارسينا، ميكرو كوك ها، لاكتوباسيل ها، استرپتوميسس ها ، كانديدا و ساكارو ميست ها بودند , بعلاوه كلي فرم ها و ديگر ميكروبهاي ميله اي گرم منفي مشخص گرديدند.

 برخي از اين ميكروارگانيسم ها توسط محققين قبلي تشخيص داده شده بودند. جالب است اشاره شود كه همان گروههاي ميكروفلور و حتي همان گونه ها و جنس هاي جدا شده از سطح بدن زنبوران كارگر در معده و روده زنبوران وجود داشتند. باكتريهاي اسپوردار غالب در سطح بدن زنبوران و در معده و روده ها نشانگر اين است كه باكتريهاي معمول موجود روي گل هايي كه توسط زنبور ملاقات ميشوندپيوسته به ميزان ثابت داخل دستگاه گوارش وجود داشته چون شهد و گرده تنها منبع غذايي زنبوران ميباشند.

در روده نه تنها باكتري های اسپوردار غالب بودند بلكه گونه هاي لاكتوباسيل به ميزان قابل توجهي وجود داشتند. اين وضعيت احتمالاً بدليل شرايط ايده آل حاكم در روده براي اين باكتريهاست . اين موضوع با يافته هاي كلوگ 1963 مبنی بر وجود گونه هاي باسيلوس و لاكتوباسيلوس  در رودة زنبوران تناسب دارد. بنظر ميرسد ميزان نسبتاً پايين مخمرهاي يافت شده در درون و سطح بدن زنبوران عسل نيز از شهد گلها منشأ بگيرد .از گلهاي مختلفي كه توسط زنبور ملاقات ميشود در سال 1929 مخمرها را جدا كردند. تغذيه منبع تأثير گذار در فلور ميكروبي ميباشد و بنظر ميرسد كه محيط تعيين كننده تيپ هاي ميكروارگانيسم هاي موجود در سطح بدن زنبوران عسل و دستگاه گوارش باشد .

 

 منبع: :M.A.El-Leithy & K.B. El-Sibaei Egypt.j.Mic.  Microflora of Honey Bee